DynaSCOPE海量单细胞转录动态测序技术原理及应用场景

文末有彩蛋呦

单细胞测序技术以前所未有的精确性揭示了单个细胞的分子状态，解析组织异质性，成为研究复杂生物体的利器。然而，目前的单细胞测序方法仅能反映出某一时间点的单个细胞中基因表达信息，就像是一张JPG的图片信息，无法准确提供RNA在时间上的动态变化。近期新格元推出DynaSCOPE^TM海量单细胞转录动态监测试剂盒，通过整合代谢RNA标记、生化核苷转化及单细胞测序技术，区分单细胞中的“新”与“旧”RNA进行单细胞转录动力监测。将JPG图片变成GIF动图，DynaSCOPE^TM实现单细胞层面大规模动态监测，真实动态变化尽在掌握！

DynaSCOPE^TM单细胞转录动态测序技术实验流程：

与传统的单细胞转录组测序技术实验流程相比，DynaSCOPE^TM单细胞转录动态技术增加了RNA代谢标记和标记物转化过程，即在将组织制备成细胞悬液后再对细胞进行RNA代谢标记。RNA代谢标记完成的细胞悬液进行单细胞分离和核酸捕获，然后对标记物进行转化，接下来就是进行单细胞常规实验流程。

DynaSCOPE^TM单细胞转录动态测序技术原理：

DynaSCOPE^TM单细胞转录动态测序技术通过添加代谢标记物4-thiouridine(S⁴U)标记新合成的RNA。具体的：在新合成的RNA中，原本的碱基T会被S⁴U修饰，在反转录过程中被错认为碱基C，因此原本应该为碱基A的位置错配成碱基G，以此来标记新合成的RNA，通过测序分析可对新合成的RNA直接定量。

DynaSCOPE^TM单细胞转录动态测序技术能够区分“新“和”老“RNA，因此这项新技术能够：

• 评估新生RNA水平和RNA合成率

• 监测RNA的降解速率

• 分析转录组的动态表达

• 转录调控机制预测

下面用几个案例来具体介绍一下这项技术的优势及应用场景：

1、揭示小鼠神经元快速激活过程中的单细胞基因转录动态状态变化

该研究用S⁴U标记原代培养的小鼠大脑皮层神经细胞，其间用氯化钾(KCl)激活这些细胞(15-120min)，进行单细胞转录组动态测序，以研究神经元激活过程中的转录动态变化。

单细胞转录组动态测序将大脑皮层神经元聚类成不同细胞类型，包括兴奋性神经元(Ex)、抑制性神经元(Inh)和神经元前体细胞(NP)并鉴定出少量的放射状胶质细胞(RG)。主成分分析表明：使用new RNAs或new与total RNAs比率(NTR)可以完全将激活的与静止状态的Ex分开。total RNAs或old RNAs上的PCA只能将激活和静止的Ex部分分开，可能是由于某些old RNAs的神经元活性调节的稳定性所致。一些神经活性调节的基因(Activity-regulated genes, ARGs)，例如Jun和Btg2在兴奋性神经元中特异性诱导，并且通过new RNAs鉴定出来。而响应活性在old RNAs水平几乎没有变化。因此，单细胞转录组动态测序揭示了细胞类型特异性，活性诱导的即时转录变化。

传统的RNA velocity利用已剪切(无内含子)和未剪切(有内含子)的转录本信息来间接地预测细胞中基因表达的变化趋势。由于Jun, Fos等早期响应基因内含子长度较短，基于传统RNA velocity方法无法准确估计这些基因的动态变化，因此无法鉴定到神经元激活早期(0–15min)的变化。而基于mRNA代谢标记的RNA velocity分析，能准确捕获神经元激活早期(0–15min)和晚期(30–120min)的变化。因此，基于新生成转录本的RNA velocity能够直接利用实验准确定量的新、旧转录本的信息，推测mRNA的动态变化，不受基因结构(内含子比例)影响，兼具准确性和适用性。

2、小鼠胚胎干细胞不同细胞状态的mRNA丰度调节策略

细胞中RNA的丰度由转录、加工、降解等过程共同决定，准确测定细胞群体中稀有或动态变化的细胞类型中mRNA合成和降解速率是一个重要而充满挑战的问题。

该研究利用单细胞转录组动态测序技术鉴定出小鼠胚胎干细胞的几种不同的状态，并对差异表达基因的合成和降解速率进行测定，通过这些差异基因在不同细胞状态间变化的趋势确定了3种不同的mRNA丰度调节策略：协同调控(RNA合成与降解动力学负相关)；中间态(与合成速率相比，RNA降解速率的相对变化较小)；不稳定性(合成率和降解率同时增加或减少)。

3、皮质醇反应中转录组动力学的图谱

该研究用DEX对HEK293T(人)和NIH/3T3(小鼠)细胞的混合物进行不同时间的处理(0，2，4，6，8，10h)，并对处理后的细胞进行单细胞转录组动态代谢测序，获得了6680个单细胞图谱。结果显示，在DEX处理的细胞中，新合成的转录组与糖皮质激素受体(GR)反应关联。同时通过识别驱动新的mRNA合成的TF模块，来探索动态的基因调控过程，确定了29个TF和532个基因之间的986个链接。计算了每一对TFs在每个细胞中的活性之间的相关系数，确定了几个重要的TF模块：与细胞周期相关的TF模块，如E2F1和FOXM1；与GR响应相关的TF模块，如FOXO1、CEBPB、JUNB和RARB；GR激活的G1/G2/M期细胞相关TF模块，如KLF6, TEAD1和YOD1；分化的GR激活的G1期细胞相关TF模块。为研究基因的转录调控机制提供了新的视角。

4、研究裂解性巨细胞病毒在单个小鼠成纤维细胞中的感染情况

单细胞转录组动态测序结果显示：total RNA和old RNA，不能区分感染巨细胞病毒的细胞和未感染的细胞。new RNA只能有轻微的区分。相比之下，NTR上的PCA可高精度从感染细胞中分离出未感染的细胞。这是由于细胞间异质性超过了病毒诱导的变化，这种变化在感染后两小时内很难在总RNA中检测到。为了评估巨细胞病毒感染对细胞基因表达的影响，从total、new和old RNA中鉴定了巨细胞病毒感染和未感染的单细胞之间差异表达的基因，发现大多数下调和上调基因只有通过新的RNA才能被发现。

以上案例发现，新生RNA的研究对于区分不同反映情况的细胞亚型、细胞状态变化和理解基因表达调控的重要性不言而喻。DynaSCOPE^TM为转录组动态研究提供了可能，为科研助力。

最后，DynaSCOPE^TM潜在的应用领域，如下图所示：

我是彩蛋！

DynaSCOPE^TM单细胞转录动态监测试剂盒已于4月21号重磅上市，新格元公众号将于5月10日推出“早鸟尝鲜“活动，参与活动即可领取精美小礼物，勿忘相约哟~

参 考 文 献

1、Qiu Q, Hu P, Qiu X, Govek KW, Cámara PG, Wu H. Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq. Nat Methods. 2020 Oct;17(10):991-1001. doi: 10.1038/s41592-020-0935-4. Epub 2020 Aug 31. PMID: 32868927.

2、Cao J, Zhou W, Steemers F, Trapnell C, Shendure J. Sci-fate characterizes the dynamics of gene expression in single cells. Nat Biotechnol. 2020 Aug;38(8):980-988. doi: 10.1038/s41587-020-0480-9. Epub 2020 Apr 13. PMID: 32284584; PMCID: PMC7416490.

3、Erhard F, Baptista MAP, Krammer T, Hennig T, Lange M, Arampatzi P, Jürges CS, Theis FJ, Saliba AE, Dölken L. scSLAM-seq reveals core features of transcription dynamics in single cells. Nature. 2019 Jul;571(7765):419-423. doi: 10.1038/s41586-019-1369-y. Epub 2019 Jul 10. PMID: 31292545.

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